Was ist bradford assay?

Bradford-Assay

Der Bradford-Assay ist eine spektrophotometrische Methode zur Bestimmung der Proteinkonzentration in einer Lösung. Er basiert auf der Bindung des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G-250 an Proteine.

Prinzip:

Das Prinzip des Bradford-Assays beruht auf der Verschiebung des Absorptionsmaximums des Coomassie Brilliant Blue G-250 Farbstoffs bei Bindung an Proteine. In saurer Lösung liegt der Farbstoff in einer rotbraunen Form vor (ungebunden), mit einem Absorptionsmaximum bei 465 nm. Bei Bindung an Proteine verschiebt sich das Absorptionsmaximum zu 595 nm und die Lösung wird blau. Die Intensität der Blaufärbung ist proportional zur Proteinkonzentration.

Reagenzien:

Das wichtigste Reagenz ist die Bradford-Reagenz, welche Coomassie Brilliant Blue G-250, Ethanol und Phosphorsäure enthält.

Durchführung:

1. Eine Reihe von Proteinstandards bekannter Konzentration wird hergestellt (z.B. Bovine Serum Albumin (BSA)).
2. Proben unbekannter Proteinkonzentration werden ebenfalls vorbereitet.
3. Die Bradford-Reagenz wird zu den Standards und Proben hinzugefügt.
4. Die Lösungen werden für eine bestimmte Zeit inkubiert (meist 5-10 Minuten).
5. Die Absorption der Lösungen wird bei 595 nm mit einem Spektralphotometer gemessen.
6. Eine Standardkurve wird erstellt, indem die Absorption der Standards gegen die entsprechenden Konzentrationen aufgetragen wird.
7. Die Proteinkonzentration der unbekannten Proben wird anhand der Standardkurve bestimmt.

Vorteile:

• Schnell und einfach durchzuführen.
• Sensitiv.
• Relativ wenige Interferenzen durch andere Substanzen (im Vergleich zu anderen Proteinassays).

Nachteile:

• Nichtlinearität bei hohen Proteinkonzentrationen.
• Variabilität der Farbreaktion je nach Protein. Unterschiedliche Proteine können zu unterschiedlichen Extinktionskoeffizienten führen, was zu einer Ungenauigkeit der Bestimmung führen kann. Es ist wichtig, einen Standard zu verwenden, der dem zu messenden Protein möglichst ähnlich ist. Weitere Informationen zu dieser Problematik findet man unter Protein %20Variabilität.
• Der Farbstoff kann an Küvetten binden.
• Bestimmte Substanzen (z.B. Detergentien) können die Messung stören. Weitere Informationen zu diesen Störungen findet man unter Substanzen%20Interferenzen.
• Die Bindung des Farbstoffs an das Protein kann zu einer Überschätzung der Konzentration führen, da die tatsächliche Konzentration niedriger sein kann. Weitere Informationen hierzu findet man unter Konzentrations%20Überschätzung.

Anwendungen:

Der Bradford-Assay wird häufig in der Biochemie, Molekularbiologie und Proteinforschung verwendet, um Proteinkonzentrationen für verschiedene Anwendungen zu bestimmen, z.B. für die Vorbereitung von Proben für die Gelelektrophorese, Western%20Blot oder andere biochemische Analysen.